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Microscopio Confocal Uso y precios |
El microscopio confocal tiene un rendimiento superior en comparación con un microscopio óptico tradicional. Las imágenes bidimensionales son, de hecho, mucho más claras que las obtenidas con un microscopio clásico. Además, el valor añadido de un microscopio confocal reside en las reconstrucciones tridimensionales de las muestras examinadas.
En este artículo nos centraremos en este tipo de microscopios, analizando también su modo de funcionamiento. A continuación haremos una distinción adicional entre microscopios confocales de barrido láser y microscopios confocales e interferométricos. Si te apasiona la ciencia y la microscopía, ¡mantente atento!
🔬 Cómo usarlo
El microscopio confocal se basa en un tipo de operación no destructiva que implica el seccionamiento óptico de una muestra. Esta técnica implica iluminar únicamente el plano focal que se observa, de modo que se adquieren imágenes dispuestas en diferentes planos focales y la resolución de la imagen es mayor. No hay partes de la imagen perturbadas porque provienen de planos desenfocados.
Los microscopios confocales utilizan una fuente de luz caracterizada por radiación láser capaz de escanear la muestra que se examina.
Los modelos más populares, pertenecientes a esta categoría, se denominan de hecho microscopios confocales de barrido láser. El acrónimo es CLSM (Microscopio Confocal de Barrido Láser). Se trata de dispositivos utilizados principalmente en el ámbito científico y más precisamente en el ámbito biomédico.
La luz, producida por el plano focal, es recogida por el sistema fotomultiplicador, para así crear la imagen final que observamos. La imagen final, por tanto, se genera en su mayor parte por la luz que proviene de una pequeña sección de la muestra, es decir, la cercana al plano enfocado, y solo en una pequeña medida por la que se origina en los planos desenfocados.
La imagen final es la representación clara y nítida de una parte de una muestra bajo observación. Cambiando el plano de enfoque se pueden obtener imágenes de otras secciones de la muestra: el conjunto de todas estas secciones nos permite crear reconstrucciones tridimensionales de la muestra.
La fluorescencia puede ser típica del material que estamos analizando; En este caso hablaremos entonces de autofluorescencia. Sin embargo, cuando la fluorescencia se genera a través de colorantes específicos que se combinan con la muestra, hablamos de fluorocromos. Estas últimas sustancias se utilizan mayoritariamente para la investigación biomédica ya que pasan a través de las células y, mediante reacciones químicas, permiten la emisión de fluorescencia desde las células.
Para trabajar en fluorescencia debemos tener en cuenta las longitudes de onda del láser que estemos utilizando y el tipo de líquido. También necesitamos utilizar la intensidad de láser adecuada para evitar que los fluorocromos se apaguen. Este fenómeno se denomina blanqueamiento.
No se deben utilizar fluorocromos al manipular materiales autofluorescentes.
🔬 Cómo se fabrica
El microscopio confocal de barrido láser se caracteriza por una serie de componentes, cada uno fundamental para el funcionamiento del instrumento científico.
Sus elementos principales son:
- Fuente de luz: está compuesta por un rayo láser monocromático. La longitud de onda varía según la fuente láser, pero puede modificarse mediante software. Para garantizar la intensidad adecuada, primero se filtra el haz de luz.
- Primer Estenopeico: es el estenopo, es decir el disco perforado que permite iluminar una pequeña parte de la muestra. Su función es dar lugar a una fuente de luz.
- Espejo Dicroico: permite separar la luz de excitación de la luz de emisión. También puede ser capaz de reflejar luz por debajo de una determinada longitud de onda, así como permitir que pase a través de él luz con longitudes de onda más largas.
- Portamuestras: es la base sobre la que se coloca la muestra. El platillo se puede mover con pequeños movimientos mecánicos.
- Segundo Pinhole: es el componente del microscopio confocal de barrido láser que permite cancelar los rayos provenientes de los planos fuera de foco;
- Detector: cuando la señal llega al detector, se transforma en digital y se transmite al PC para proceder a la adquisición de datos e información.
La fuente y el detector de un microscopio confocal se conectan al ordenador personal a través de fibra óptica. El ordenador es uno de los componentes más importantes de este tipo de microscopio, ya que permite modificar los parámetros, desde el tipo de láser utilizado hasta la metodología de observación, que puede ser por reflexión o fluorescencia.
El microscopio se conecta al ordenador mediante una cámara que transmite las imágenes de lo que se observa para que se puedan visualizar en tiempo real en la pantalla.
El siguiente paso implica la reconstrucción 3D de las imágenes recopiladas; Esta operación se realiza mediante un software específico. Las reconstrucciones pueden ser tanto transversales como longitudinales según las necesidades y requerimientos.
🔬 Ventajas y limitaciones
Las ventajas de utilizar un microscopio confocal de barrido láser son realmente numerosas. Enumeramos algunas de ellas para dejar más clara la importancia de utilizar un aparato científico de este tipo:
- la técnica no es destructiva;
- la recogida de datos se produce a gran velocidad;
- el área examinada es muy pequeña. Incluso puede ser tan pequeño como unas pocas decenas de micras de lado:
- El microscopio confocal de barrido láser es capaz de reducir la información procedente de los planos desenfocados por medio de orificios;
- Este dispositivo puede funcionar en dos modos diferentes: tanto en reflexión como en fluorescencia.
Por supuesto, existen algunas limitaciones. Entre los puntos débiles de un microscopio confocal de barrido láser está el hecho de que, si se trabaja en reflexión sobre materiales no transparentes, no se pueden superar profundidades de unas pocas decenas de micras porque no hay suficiente luz para proceder al barrido.
🔬 Tipos de microscopios confocales
Los microscopios confocales se pueden dividir en dos categorías: microscopios confocales de barrido láser y microscopios confocales e interferométricos. Ambos cuentan con un PC integrado con software compatible con Windows. Hay varios aspectos que los diferencian entre sí.
Los microscopios confocales e interferométricos se caracterizan por la tecnología confocal y las técnicas interferométricas. Son instrumentos que se utilizan para adquirir imágenes topográficas tridimensionales.
Los microscopios confocales e interferométricos se diferencian de los microscopios confocales de barrido láser clásicos porque la fuente de luz utilizada es luz blanca (no el láser) que es emitida por el LED y cuya intensidad es ajustable. Además, estos dispositivos no permiten el seccionamiento óptico a diferencia de los modelos examinados anteriormente. Estos microscopios funcionan mediante un software integrado en el ordenador. Las imágenes de la muestra se pueden capturar en forma bidimensional o tridimensional.
El método de observación de un microscopio láser de barrido confocal es reflexión o fluorescencia, mientras que el de un microscopio confocal e interferométrico es solo reflexión.
También se proporcionan reconstrucciones 3D en caso de utilizar un microscopio confocal e interferométrico. microscopio, pero sólo si se hace referencia a la superficie. La fuente de luz no es el láser sino la luz blanca del LED. La preparación de muestras, que se requiere para los microscopios confocales de barrido láser, no es necesaria para los microscopios confocales e interferométricos. Las dimensiones de las muestras son estándar en el primer caso mientras que para la segunda categoría de microscopios las dimensiones pueden ser nanométricas y centimétricas.
Los microscopios confocales e interferométricos permiten detectar la cuantificación de la rugosidad superficial de forma más específica que los microscopios confocales de barrido láser. Estos últimos, sin embargo, son capaces de detectar la porosidad más profundamente. Los microscopios confocales e interferométricos revelan únicamente la porosidad de la superficie.
Los microscopios confocales de barrido láser permiten, mediante el seccionamiento óptico de la muestra, reconstruir la estructura interna de los objetos examinados. Los microscopios confocales e interferométricos se utilizan para reconstruir superficies y son ideales para medir la rugosidad de la superficie.
Los microscopios confocales de escaneo láser requieren muestras preparadas en secciones delgadas, mientras que los microscopios confocales e interferométricos pueden utilizar tanto secciones delgadas como muestras de hasta unos pocos centímetros de tamaño.
🔬 Software
El software tiene un papel muy importante cuando tienes un microscopio confocal en tus manos. Se utilizan para procesar datos pero sobre todo también para comprobar los parámetros de funcionamiento de los aparatos científicos. Con este software es posible configurar, de hecho, el zoom, el tipo de láser utilizado, el tipo de investigación, la intensidad de la fuente de luz.
El software también se utiliza para procesar los datos, a través de reconstrucciones 3D, secciones ópticas, tipo de rugosidad. Por último, algunos de estos programas permiten insertar textos, flechas, formas a las imágenes captadas por nuestro microscopio durante el análisis de las muestras a examinar.
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